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May 21, 2023

化石魚の耳石と生体鉱物結晶ホストの原始的な保存に関する最初の古プロテオーム研究

Rapporti scientifici Volume 13,

Scientific Reports volume 13、記事番号: 3822 (2023) この記事を引用

1013 アクセス

20 オルトメトリック

メトリクスの詳細

耳石は、硬骨魚類の聴覚と体のバランスの維持に関与する静音響器官の炭酸カルシウム成分です。 それらの形成中、形態や炭酸塩多形などの制御は、複雑な不溶性コラーゲン様タンパク質と可溶性非コラーゲン性タンパク質の集合体によって影響されます。 これらのタンパク質の多くは、アラゴナイトの結晶構造に組み込まれています。 しかし、化石記録では、これらのタンパク質は続成過程によって失われたと考えられており、過去の生体石灰化メカニズムの研究が妨げられています。 今回我々は、中新世（約14.8～14.6Ma）のメルルーサの耳石に11種類の魚類特異的タンパク質（およびいくつかのアイソフォーム）が存在することを報告する。 これらの化石耳石は、水を通さない粘土の中に保存されており、現代の代表的なものと見分けがつかないほどの顕微鏡的および結晶学的特徴を示し、極めて原始的な保存状態と一致しています。 実際、これらの耳石化石には約 100 グラムの成分が保存されています。 現代の対応物から配列決定されたタンパク質の10%には、耳石の感覚上皮への配置に関与するオトリン-1様タンパク質や無細胞膜に位置するオトゲリン/オトジェリン様タンパク質など、内耳の発生に特異的なタンパク質が含まれます。現代の魚の内耳の膜。 これらのタンパク質の特異性により、外部汚染の可能性が排除されます。 現生のメルルーサの耳石化石と同一のタンパク質の一部が同定されたことは、内耳の生体石灰化プロセスが長期にわたり高度に保存されていることを示唆している。

パレオプロテオミクスは、時間の経過による生物鉱化プロセスの進化などに関する新たな視点を提供し、化石遺跡についての理解をさらに洗練させる、加速している研究分野です1。 DNA は細胞死後に比較的早く分解するため、古代 DNA の研究は数百万年に限定されていますが 2、化石記録に残るより安定したタンパク質の研究は、タンパク質の機能と地質学的時間スケールにわたるその進化を調査する機会を提供します。 数百万年から数億年3. 骨、歯、貝殻などの生体鉱物の古プロテオミクス研究は、そのような構造がよく保存された化石標本に埋め込まれたタンパク質残基を保存する可能性が高いため、特に有望です。 ここでは、硬骨魚類の内耳 (耳石) の化石化した炭酸カルシウム構造におけるこの可能性を探ります。 魚の耳石は、魚の骨学的遺骸とは対照的に、中生代の化石記録で頻繁に発見され、新生代の地層ではその量が増加しています4。 これらの化石は、分類群に特有の形態のため、魚類の古生物多様性の解釈や、同位体および微量元素の組成に基づいた古環境の再構築の鍵となります5。 耳石の炭酸カルシウムの鉱物構造は、無機的に沈殿した結晶の集合体に似ていることがありますが、実際には、他の多くの生体炭酸塩と同様、複雑な有機鉱物複合体です6。 現代の耳石の生体石灰化プロセスの研究では、有機高分子、特にタンパク質が、カルシウムの輸送、核形成、結晶化部位での飽和状態の制御など、耳石形成の重要な側面を制御し、アラゴナイト結晶の成長を積極的に調節していることが示されています8。 実際、特定の炭酸カルシウム多形（方解石やバテライトとは対照的にアラゴナイト）の厳密な選択は、成長する結晶表面にカルシウムカチオンを引き付けるアスパラギン酸やセリン残基などのタンパク質によって制御されることも示されています。そして、イオンのより高密度な（すなわち、アラゴナイト状の）充填を好む9。 現在までに、数百のタンパク質が現生魚の耳石で同定されており、その多くは生体石灰化に直接関与していると考えられています10。 耳石の生体石灰化に関与することが知られているタンパク質は、(1) 構造的不溶性コラーゲン様タンパク質の複合体、および (2) 可溶性非コラーゲン性タンパク質 (NCP) の 2 つの主なグループに分類できます。 オトリン-1 などのコラーゲン様タンパク質は、成長する生体ミネラルの足場を作成します。 オトリン-1 は、軟骨内骨化と骨折修復にも関与するタンパク質であるコラーゲン X と配列の相同性を持っています11。 可溶性 NCP は通常、核形成、配向、結晶成長を直接制御する強酸性の本質的に無秩序なタンパク質 (IDP) です。 このような IDP は、ゼブラフィッシュの Starmaker (Stm) 7、メダカの Starmaker 様 (Stm-1) 12、ニジマスの耳石マトリックス高分子 64 (OMM-64) 13 など、いくつかの魚分類群で同定されており、生体ミネラル化におけるそれらの役割も明らかにされています。は徹底的に特徴付けられています14、15、16、17。

化石耳石に埋め込まれたタンパク質の証拠を発見できれば、重要な水生生物鉱石化プロセスの進化についての理解が深まるだろうが、そのような残留物はまだ特定されておらず、一般にこれらの有機成分は耳石の続成変化によって分解され失われると考えられている。アラゴナイトの多形体。これは準安定であり、通常は、例えば活性溶液の存在下での溶解 - 沈殿プロセスを介して、より安定な方解石に変化します18。 このような続成過程は、多くの結晶間/結晶内タンパク質、特に不安定性の高い NCP の保存にも強く影響します 19。 化石耳石中のそのようなタンパク質の残骸の検出と同定に成功するために、私たちは、水不浸透性の堆積物に保存され、現代の対応物と同様の超微細構造的特徴を持つ完全にアラゴナイトで構成されている標本のみが、有機成分を保存する可能性があるという仮説を立てました。最も可能性が高いのは、アラゴナイト結晶の内部に埋め込まれたインクルージョンです。 硬骨魚類の、見つけやすい矢状中新世の耳石化石の中には、これらの基準を満たすものもあります。 今回我々は、コリトニツァ（ポーランド中部、聖十字架山脈、資料参照）に露出した中新世（約1,400万年前）の水不浸透性粘土で発見されたメルルーサの化石耳石に埋め込まれたタンパク質の検索結果を報告する20。

Phycis spp.の現代（白色）および化石（茶色がかった色）の矢状耳石。 細くて細長い炭酸カルシウムの生体ミネラル構造です。 前部では幅が広く、後部に向かって徐々に狭くなります（図1a、h）。 内面 (近位面) は凸面であり、明確な耳溝 (感覚組織が耳石と接触する領域) はありません。 外面（遠位面）は、最も一般的には不規則な肥厚/隆起と溝で構成されています（図1a、h）。 偏光透過光と通常の透過光の両方で観察された縦方向の薄切片 (つまり、矢状面内) は約 100 を示します。 表面の突起にサイズが対応する厚さ500μmの柱状ユニット（図1c、j）。 時折、紡錘形の空隙が柱状ユニット間に発生し、これは隣接する表面突起の間の溝に対応する可能性があります（図1c、jの白い矢印）。 現代耳石と化石耳石の縦断面図の柱状ユニットと他の部分（近位）には、多数の層（濃褐色と無色の交互のゾーン、厚さ約5〜7μm）が見られます。図1c、d、j、k。層は構成されています結晶方位画像 (EBSD) で現生サンプルと化石サンプルに同様のサイズで存在する結晶 (図 1e、l) 相マップにより、現生サンプルと化石サンプルの両方の厳密なアラゴナイト鉱物学が確認されました (図 1f、m)。結果として得られた極点図は、現代 (図 1g) と化石標本 (図 1n) の間で完全に比較可能であり、結晶サイズ、傾斜、方位角分散、乱層分布についても、現代と化石標本の高度な類似性が観察されました。面 (222) (図 1g、n). 現生お​​よび化石耳石のアラゴナイト繊維は、幅約 200 ～ 300 nm の細長い単位で構成されており、ナノ粒子組織を示します (図 2a、b、g、h)。直径 50 ～ 100 nm は、AFM 高さおよびピークフォースエラーモード画像ではっきりと確認できます (図 1)。 2c、d、i、j)。 骨格ラメラのTEM観察（集束イオンビームによって抽出）は、成長方向に対して斜め（図2e）または縦方向（図2k）に切断されたFESEMで観察されたものとサイズが同等のアラゴナイトの微細スケールの繊維を示します。 繊維には、サイズが2〜25 nmの範囲の結晶内低密度欠陥（包含物）が多数含まれており、TEM画像では明るい点としてはっきりと見えます（図2f、lの白い矢印）。 これらの内包物は、縦方向の切断に見られるように、結晶成長方向に対して垂直に整列しています（図2f、l）。 同様の低密度の材料も粒界に位置しています（図2e、k）。 現代のサンプルと化石サンプルは全体的に同様の重量減少プロファイルを示していますが、微分曲線は分解の違いを示唆しています。 現代の耳石は、現代のものと比較してより広い温度範囲（約200～430℃対250～400℃）で分解し、いくつかの重量減少段階（約210℃、360℃、および410℃）を示します。 C）化石耳石の比較的大きな重量減少（約340℃）と比較して（補足図S1）。

現代の Phycis phycis (a ～ g) と化石 Phycis tenuis (h ～ n) の矢状耳石の形態学的、微細構造および結晶学的類似性。 現生 (a) と化石 (h) の矢状体はスリムで細長いです。 外面 (遠位面) は、最も一般的には不規則な肥厚/隆起と溝で構成されています。 偏光（b、c、i、j）および通常の透過光（d、k）での薄切片は、多数の年輪を示し、隆起（縦方向に切断された柱、時には紡錘形の空隙、白い矢印によって分離される）の個体発生的連続性を示しています。 ）。 結晶方位画像 (EBSD) は、現代サンプル (e) と化石サンプル (l) の同様のサイズのアラゴナイト結晶を示しています (相マップ (f、m) は両方のサンプルのアラゴナイト鉱物学を確認します)。 極点図は、現代 (g) と化石サンプル (n) の間で完全に比較可能です。面内での結晶サイズ、分布、傾斜、方位角分散、乱層分布が同じです (222)。 ZPAL P.21/R-OTH-242/001 (a–g); ZPAL P.21/ C-OTH-07/006 (h–n)。 MTEX の BungeColorKey パレット (色覚異常ユーザーにとってより使いやすい) を使用して、方位画像と極点図を作成しました。

Phycis phycis (a ～ f) および化石 Phycis tenuis (g ～ l) の矢状耳石の複合有機鉱物構造。 FESEM では、現代の耳石と化石の耳石のアラゴナイト繊維は、約 100 mm の細長い単位で構成されています。 幅 200 ～ 300 nm (a、g)、高倍率 (b、h) ではナノ顆粒組織を示します。 ナノグレイン約 AFM 高さモード (c,i) およびピーク フォース エラー モード (d,j) 画像では、直径 50 ～ 100 nm が見えます。 骨格薄板の TEM 観察 (集束イオン ビームで抽出) では、多数の有機内包物 (f、l の矢印) を含むアラゴナイトの微細な繊維 (FESEM で観察されるものとサイズが同等) が示されます。 (e) の繊維は、成長方向に対して斜めまたは縦方向 (k) に切断されます。 ZPAL P.21/R-OTH-187/002 (a–f); ZPAL P.21/C-OTH-07/007 (g–l)。

化石耳石サンプル中のアミノ酸のラセミ化とその相対含有量は、タンパク質分解の代用として使用されました。 分析は化石の P. tenuis 耳石を使用して行われ、現生の P. tenuis と直接比較されました。 測定には、バイオミネラル内に元々存在する遊離アミノ酸 (FAA) と、完全なペプチドを個々のアミノ酸に加水分解する際に形成されるアミノ酸 (いわゆる総加水分解性アミノ酸、THAA) が含まれていました。 FAA は高度にラセミ化された N 末端アミノ酸の加水分解から生じる傾向があるため、特定のアミノ酸の FAA の D/L 比は THAA の D/L 比よりも高くなります。 予想どおり、遊離アミノ酸 (FAA) と重合アミノ酸 (THAA-FAA、出発耳石 1 mg あたりの pmol アミノ酸) のプール間のアミノ酸の分布は、現代の標本のほとんどのアミノ酸が無傷のペプチドの一部であることを示しています。化石ペプチドの大部分は個々のアミノ酸に分解されています。 化石標本では、酸性アミノ酸のアスパラギン酸とグルタミン酸を含む Asx と Glx の両方、および Ser の劇的な損失が観察されました (表 1)。

合計で、132 の魚特有のタンパク質といくつかのアイソフォームのペプチドが現生の P. phycis 耳石で検出されました (補足表 S2)。一方、11 の魚特有のタンパク質のペプチドが化石 P. tenuis 耳石で見つかりました (表 2、補足表 S3) –S5)、これは現代のサンゴ骨格と化石サンゴ (アラゴナイト) 骨格のそれに匹敵する収益率です 21,22。 すべての標本の両方の酸可溶性画分にわたってタンパク質が観察され、現代のサンプルではGluCによりタンパク質の検出が向上しましたが、化石サンプルではトリプシン消化ペプチドのみが検出されました（補足表S6）。 さらに、アスパラギンとグルタミンの脱アミド化とメチオニンの酸化が検出されました（補足表S6）23。 化石耳石から配列決定された 11 個のタンパク質のうち 5 個は、内耳で発現する遺伝子によってコードされるタンパク質 (すなわち、α-テクトリン、β-テクトリン、オトリン-1 様、オトゲリン/オトジェリン様、およびオトジェリン様) を表します。 他の 6 つのタンパク質は現生の魚の耳石に存在しますが、内耳機能に特有のものではありません。 化石ではなく現生の耳石で発見されるタンパク質には、例えば、内耳の発達と恒常性にとって重要なタンパク質であるウシェリンが含まれる。 他の現代の耳石タンパク質には、数種類のコラーゲン、コンタクチン、低密度受容体関連リポタンパク質、CO2と重炭酸塩を相互変換する炭酸脱水酵素が含まれます（補足表S2）。

炭酸塩を含むバイオミネラルの最も際立った特徴の 1 つは、それらが常に有機ミネラル複合体であり、多糖類、脂質、タンパク質などの有機成分が無機ミネラル相に取り込まれ/埋め込まれ、メソスケールからナノスケールの構造を形成していることです。結晶内および結晶間の介在物およびネットワーク 24、25。 これらの有機成分は、生理学的に媒介される生体ミネラル形成プロセスに関与します。 プロテオームプロファイルはトランスクリプトームリソース/発現と関連付けることができるため、現代の生体ミネラル構造のプロテオームの研究は、生体ミネラル化の分子機構についての洞察を提供します。 したがって、化石生物鉱物構造中のタンパク質を同定することで、約 10 年前よりはるかに古い化石に保存された DNA が存在しない場合でも、ゲノム関連情報に間接的にアクセスできるという期待が高まります。 2 そうですね、これを超えると DNA は化石記録に一般的に残存しなくなる 26,27 。

さまざまな化石生物鉱物構造から古プロテオームデータがますます抽出されています 21、28、29、30、31。 しかし、現在まで、中生代および新生代の堆積物で最も豊富な魚類の化石を代表する化石耳石からの古プロテオーム情報は存在しません。 この研究は、同属の現生耳石（フィシッド・ヘイク）のプロテオームと直接比較して行われた化石耳石のタンパク質同定に関する最初の報告である。 以下の議論は、原始的な古プロテオミクス情報を保存する化石生体鉱物の構造基準と、現生および化石メルルーサの耳石のタンパク質含量の比較分析という 2 つの重要な側面に焦点を当てます。

この研究のために選択された化石材料は、アラゴナイト生物鉱物の例外的な保存でよく知られている産地であるコリトニカ産のものです（「材料」セクションも参照）。 実際、ここで研究したすべての化石耳石サンプルでは、​​アラゴナイト炭酸塩多形のみが検出されました。 すなわち、二次方解石または他の二次相の存在の証拠は観察されませんでした。 これらの化石耳石の並外れた保存状態は、その結晶学的および超微細構造的特徴によってさらに裏付けられており、結晶サイズの分布、方位/傾斜、方位角分散、乱層分布 (面 (222)) の点で、現代の対応物を特徴づけるものと区別がつきません。 (図 1、2) これらの化石耳石が極めて原始的な保存状態であることのさらなる証拠は、耳石や他のほとんどの生体鉱物に典型的なナノ粒状組織の出現によって提供されます 6,34,35。通常、原子間力顕微鏡で視覚化される（図2c、d、i、j）は、非晶質前駆体を含む生体石灰化プロセスの生成物であると考えられています36、37。このプロセスでは、有機分子が組織内に取り込まれます。例えば、内包物として、および結果として得られるナノ粒子の周りの有機物に富んだ「エンベロープ」として生体ミネラルを結晶化する（図2e、f、k、l）25. 炭酸塩生体ミネラル化プロセスに関与する個々のタンパク質は、最大数百kDaの質量と、直径/半径が数ナノメートルから数ナノメートルのランダムコイル（構造化/IDPタンパク質）。 結晶構造へのそれらの埋め込みは、結晶内および結晶間の包有物の発生として解釈されました38,39。 このような内包物は、ここで分析した現代および化石の耳石サンプルに一貫して存在しており、これらがこの研究におけるタンパク質性物質の主な供給源であると想定されます。 以前の（古）プロテオミクス分析では、サンプルの保存可能性を評価するために、アミノ酸のラセミ化とその相対含有量の測定が検査されました40。 タンパク質の分解は、遊離アミノ酸 (FAA) と重合アミノ酸 (THAA-FAA、出発耳石材料 1 mg あたりの pmol アミノ酸) のプール間のアミノ酸の分布によって明らかに示唆されます。 ほとんどの化石ペプチドは個々のアミノ酸に分解されています。 化石標本で観察された酸性アミノ酸への偏りは、強酸性タンパク質（一般に生体鉱物に共通）が生体鉱物のより可溶性の高い部分の一部であり、優先的に分解されたことを示唆しています。 これは、LC-MS/MS によって配列決定されたタンパク質の種類に反映されています (表 2)。 タンパク質の分解は、熱重量データによっても裏付けられます。 最近のサンプルのサーモグラムは、化石サンプルと比較して、より広い熱分解範囲とより多くの重量減少ステップを示しています。 最近のサンプルには、熱分解に対する感受性が異なる有機化合物が含まれているため、その分解温度範囲が比較的広いことは驚くべきことではありません。 したがって、現代の耳石にはより多様な有機（タンパク質性）成分が含まれていると考えられます。これは、有機の多様性が小さい化石耳石と比較して、より高い熱分解範囲（重量減少ステップの数）によって明らかです。

現生成体フィシス・フィシスの耳石からは130以上のタンパク質が同定された。 これらには、耳石で以前に同定されているオトリン、オトジェリン、ウシェリン、コクリンが含まれます41,42。 検出された現代の耳石タンパク質のうち、11 個は化石の P. tenuis 耳石でも観察されました。 これらには、αおよびβテクトリン、2つのオトジェリン様タンパク質、オトリン-1様、およびニューロセルピンが含まれ、これらはすべて炭酸カルシウムの生体石灰化に直接関与していることが示唆されています。 我々はまた、化石耳石から、これまで魚類の耳石から詳細に説明されていなかったコラゲナーゼなどの追加のタンパク質を同定した。 トランスフォーミング成長因子 b 誘導タンパク質、スプライシング因子。 アルギニン/セリンが豊富な19様タンパク質。 プロトカドヘリン FAT 4 様タンパク質。 そしてトロンボスポンジン。 スプライシング因子を除くこれらの追加タンパク質はすべて、細胞外または膜に結合していることを示す GO 用語を持っています。 いくつかはカルシウム結合であり、少なくとも 1 つのプロトカドヘリンは他の生物由来の生体炭酸塩で検出されています 43。

耳石マトリックスタンパク質として以前に確立されたこの特定のタンパク質一式が、ここで研究された化石耳石に保存されていた理由はいくつか考えられます。 一部のタンパク質の共保存は、生体石灰化中のそれらの密接な相互作用に起因する可能性があります。 オトジェリンとアルファテクトリンは両方とも、耳石膜を耳の感覚構造に繋ぐために必要であり44、オトジェリンは耳石の初期播種の初期幼虫の発育に重要です10。 ベータテクトリンは、生体石灰化が進行するにつれてカルシウムを隔離する可能性が高く 10、オトリンと重合して共保存を強化する可能性があります 45。 同様に、アルファテクトリンは、オトリンとの相互作用を可能にすることが提案されている N 末端 Nidogen ドメインを持っています 46。 化石耳石で検出されたタンパク質は、現代の耳石で最もスコアの高いタンパク質の一部であり（スコアが高いほど、観察されたすべての質量スペクトルと検査されたタンパク質内のアミノ酸配列の合計スコアがより確実に一致していることを示します）、これは次の点と直線的に関連していることが示されています。相対的なタンパク質の存在量47。 最後に、生体ミネラル形成のための有機足場を提供する酸性残基を持つ一部のタンパク質 (例、オトリン-1 など 48) は、カルシウムイオンによって強力に安定化されます。 このようなタンパク質は生体鉱物の表面にしっかりと付着する可能性があり、これにより化石記録における保存の可能性が高まる可能性があります29。

私たちの観察により、化石記録における炭酸塩生物鉱物の例外的な保存のための構造基準が洗練され、古タンパク質の配列は、地質時代を通じて魚類の内耳生物鉱物化プロセスが高度に保存されていることを示しています。

フォークビアード (Phycis phycis、フクロ科) 現生の耳石は、2011 年から 2012 年にかけてポルトガル本土の西海岸に沿って漁師によって釣り上げられた魚から収集されました。矢状耳石は、えらを通して腹側頭蓋切片とともに除去され、水ですすがれ、風乾され、ラベルを貼られた状態で保管されました。プラスチックチューブは分析までリスボン科学部（ポルトガル）で保管された49,50。 生体鉱物構造分析用に Phycis phycis の 2 つの大きな標本 (ZPAL P.21/R-OTH-242/001、ZPAL P.21/R-OTH-187/002) と 3 つの標本 (重量約 2.5 g) が選択されました。プロテオーム解析用に選択されました (ZPAL P.21/R-OTH-196/003、ZPAL P.21/R-OTH-197/004、ZPAL P.21/R-OTH-198/005)。

P. tenuis の矢状耳石化石サンプルは、コリトニカ粘土層から収集されました [GPS 位置: 北緯 50°39'50'' ～ 50°40'50'' および 20°31'20'' ～ 20°33'00' 'E; コリトニツァ・プレバニア、コリトニツァ・森林、リサ山33]、中新世にホーリークロス山脈の南斜面の岩海岸に沿って発達した湾の終端部分（コリトニツァ盆地）に堆積した独特の相です。中央ポーランド20. コリトニツァ盆地は、約 1000 〜 1000 の堆積物で構成される浅くなっていく堆積物で満たされています。 厚さ 30 ～ 60 m の粘土の連続で、局所的にカキの殻床と干渉しています。 コリトニカ列の絶対年齢は 14.8 ～ 14.6 Ma と推定されています 51,52 コリトニカ粘土は、中新世の化石が原始状態で保存されていることで知られています。 このような例外的な保存は、例えば、サンゴ類、腹足動物、魚類の耳石などの骨格のアラゴナイト鉱物学（通常の状態では準安定な CaCO3 多形体）と、それらの現代の対応するミクロおよびナノ構造の特徴に完全に匹敵する明確な特徴によって裏付けられています6。 化石化の異常に好ましい条件は、一部の腹足動物やフジツボの殻に残された例外的な色パターンによってさらに裏付けられています 20,53,54。 このような保存は、不浸透性の粘土に埋め込まれた化石が極限環境から実質的に遮断されていることを意味します。 ホーリークロス山脈の南郊外からパラテティス海が撤退した後、これらの堆積物は、化石物質に地熱勾配熱の影響を引き起こす可能性のある追加の厚い堆積物で覆われていませんでした。 ポーランドのシフィエントクシスキエ地域の設定日の年間平均気温は、5.61 °C (1940 年) から 10.10 °C (2019 年) の範囲です。 1901 年から 2021 年まで観察された 55。コリトニカ粘土の非常に細かい粒子の性質と、その結果としてこのような堆積物に特有の熱伝導率が非常に低いことを考慮すると、調査された耳石サンプル（今日、深さ 1 ～ 2 m で発見された堆積物から採取された）が、 ) 埋葬の歴史の間に重大な温度変動は経験していません。

粘土サンプルを洗浄し、標準ふるい (500/250/125 μm) でふるい分けし、40 °C で乾燥させました。 約 P. tenuis の 300 個の耳石標本のうち 2 つの標本が生体鉱物構造分析用に選択されました (ZPAL P.21/C-OTH-07/006 および ZPAL P.21/C-OTH-07/006)。 20 個の標本 (重量約 1.6 g) がプロテオーム分析用に選択されました (集合番号 ZPAL P.21/C-OTH-07/008-027)。 (古)プロテオーム分析用に選択された標本は、次亜塩素酸ナトリウム (5%) に 3 時間浸漬され、すすがれ、脱イオン水で超音波処理され、40 °C で一晩乾燥されました。

現代の耳石と化石の耳石の資料は、ワルシャワのポーランド科学アカデミー古生物学研究所（略称 ZPAL）に保管されています。 詳細なサンプル識別情報は補足表S1に記載されています。

耳石の構造的特徴は、ポーランド科学アカデミー古生物学研究所の透過光顕微鏡 Nikon Eclipse 80i、ワルシャワ大学化学科の電界放射型走査型電子顕微鏡 (FESEM、ツァイス・マーリン)、サーモを使用して研究および撮影されました。スイス連邦工科大学ローザンヌ校 (EPFL) の電子顕微鏡 (CIME) 中央施設にあるフィッシャー テクナイ オシリス顕微鏡、およびマルチモード 8 バージョン (Bruker) にアップグレードされたマルチモード 5 装置 (Veeco) を使用した原子間力顕微鏡 (AFM)ワルシャワ大学化学科。 光学顕微鏡画像（偏光）は、耳石の矢状面で作成された超薄（厚さ 2 ～ 12 μm）切片から撮影されました。 FE-SEM 画像は、両面接着テープと導電性白金膜でスパッタ コーティングされたスタブに取り付けられた耳石の横方向の破断部分の撮影されました。 加速電圧は 5 kV、作動距離は 4 ～ 6 mm でした。 原子間力顕微鏡イメージングは​​、専用のシリコン カンチレバーを使用して ScanAsyst モードで取得されました。 各スキャン中に 2 つの信号 (高さとピーク力エラー) が同時に収集されました。 耳石研磨矢状切片（Buehler Topol 3 最終研磨懸濁液、粒径 0.25 µm）を Milli-Q 水ですすぎ、超音波洗浄機で 10 秒間洗浄し、その後 Milli-Q 水溶液で 7 時間エッチングしました。 画像は、Nanotec57 の WSxM v5.0 Develop 10.2 ソフトウェアで処理されました。 透過電子顕微鏡 (TEM) 用のサンプルは、抽出された断面 TEM ラメラとして準備され、デュアル ビーム Gemini NVision 40 集束イオン ビーム装置を使用してミリングされました。 最初のチャンクは 30 kV、6.5 nA でガリウム イオンを使用してミリングされ、次に 80 pA を使用するまで段階的に低い電流で薄くされ、最後に 5 kV、80 pA で平滑化されます。 TEM 分析は 200 kV の加速電圧で実行されました。 走査型透過電子顕微鏡 (STEM) モードの高角度環状暗視野 (HAADF) 画像は、スポット サイズ 0.5 nm、カメラ長 115 mm で記録されました。

表面サンプル（厚いスライドの）を 1 μm、0.3 μm、0.05 μm のアルミナで研磨し、最後にコロイダルシリカ（0.05 μm）で研磨しました。 分析前に、高真空コーターを使用してサンプルをカーボンの薄層 (約 2 nm) でコーティングしました。 EBSD 研究は、ウッチ工科大学材料工学研究所の走査型電子顕微鏡 JEOL JSM-6610LV に搭載された Oxford NordlysMax 検出器を使用して実施されました。 EBSD データは、AztecHKL ソフトウェアを使用して、高真空、20 kV、大きなプローブ電流、および 20 mm の作動距離で収集されました。 EBSD パターンは、次のようなアラゴナイトと方解石に特徴的な単位胞設定を使用して結晶学的マップの 0.22 μm ステップ サイズの解像度で収集されました 58,59: 「Pmcn」対称性および a = 4.96 Å、b = 7.97 Å、および c = 5.75 Åシンクロトロン放射による粉末 X 線回折 (43) およびそれぞれ a = b = 4.99 Å、および c = 17.06 Å を使用してファビアサンゴについて推定されました。 この研究では、EBSD データは、結晶マップ、位相画像、およびアラゴナイトの (100)、(010)、(001)、および (222) 面を基準とした結晶面の立体投影を表す極点図によって表されます。 方向画像と極点図は、Matlab プログラム用の MTEX​​ オープン ソース プラグイン (https://mtex-toolbox.github.io/) を使用して作成されました。 赤と緑の色の組み合わせを排除し、色覚異常ユーザーにとってアクセスしやすい画像を作成するために、MTEX から BungeColorKey パレットを選択しました (結果は、https://www.color-blindness.com/coblis にある色覚異常シミュレーター Coblis を使用してテストされました) -色覚異常シミュレーター/)。

熱重量分析は、ワルシャワ大学化学科の TGA Q50 装置 (TA Instruments) を使用して実施されました。 耳石サンプル（それぞれ化石サンプルと最近のサンプルでは 37.48 mg と 37.16 mg）を、窒素環境下、直線勾配（10 °C min-1）下で周囲 20 °C から 550 °C まで加熱しました。

元の有機物質が耳石に残っているという仮定の最初のテストには、アミノ酸ラセミ化分析 (AAR) が含まれていました60,61。 AAR 分析により、サンプルが適切に洗浄されている (化石標本の D/L が (1) に近づいている)、元のタンパク質物質がまだ埋め込まれている (化石標本の D/L が (1) に近づいている) という情報が得られ、状態についてのアイデアが得られました。 （つまり、アミノ酸の相対濃度と存在量が現代の耳石サンプルと同様であれば、分解が最小限であることが示唆されます）。

ラセミ化分析用のアミノ酸（遊離アミノ酸および全加水分解性アミノ酸の両方）は、標準的な方法により、洗浄された骨格粉末（後述）から抽出、加水分解し、蒸発乾固しました61。 すべてのサンプルは二重に調製され、微化石用に修正を加えた標準的な方法を使用してノーザン アリゾナ大学アミノ酸地質年代学研究所で分析されました 60,62。 再水和したサンプルに内部標準として L-ホモアルギニンを添加し、逆相 C18 充填カラムを備えた HPLC に注入しました。 「ブランク」サンプルが含まれていました。 我々は以前、「クリーンスペース」の設定と取り扱いプロトコルが実験室での外因性タンパク質汚染を防ぐのに十分であることを示しました21。

化石と現生の耳石を乳鉢と乳棒で 125 μm に粉末化し、Stoll et al.63 の修正方法に従って超音波処理しながら 50:50 の濃縮漂白剤/H2O2 中で 1 時間酸化し、MilliQ で 5 回洗浄し、乾燥させました。 酸化とリンスをさらに２回繰り返した。 汚染を最小限に抑えるために、すべての取り扱いを層流フード内で行い、サンプルあたり約 0.5 g の洗浄済み粉末を 0.5 M 酢酸中で脱灰しました。 可溶性有機マトリックス（SOM）を遠心濾過（Amicon、3 kDaカットオフ）によって濃縮し、濾過したリン酸緩衝生理食塩水ですすいだ。 不溶性有機マトリックス（ＩＯＭ；４３，０００×ｇで５分間ペレット化した物質）を８０％アセトンで３回洗浄した。 化石タンパク質は、各溶解度画分の単一サンプルとして調製されました (サンプル 07)。 現代のサンプルは生物学的な 3 つのサンプルとして抽出されました (サンプル 196 ～ 198)。 サンプルを SDS バッファーに可溶化し、8 M 尿素 64 で SDS バッファーを洗い流した後、トリプシン、次に Glu-C 酵素の連続適用により、30 kDa Microcon Centrifugal Unit (Sigma Aldrich) で MED-FASP プロトコールを使用して消化しました。 サンプルは、UCLA Semel Institute プロテオミクス施設で液体クロマトグラフィー タンデム質量分析 (LC-MS/MS) によって配列決定されました。 各画分は、ベンチトップ高分解能オービトラップ質量分析計 (QE-Plus; Thermo Fisher) に接続されたナノ液体クロマトグラフィー システムで個別に分析され、データに依存した収集を行う陽イオン モードで操作されました。 MS1 は 70,000 (400 m/z) の解像度で実行され、MS2 は 17,500 で実行されました。 キャリーオーバーを最小限に抑えるために、すべてのサンプル間で器具ブランクを実行しました。 変換された質量スペクトルは、一般的な汚染物質データベースである UniProt-Human データベース、および Phycis phycis ゲノムの 65 の予測タンパク質データベースに対して Mascot で分析されました。 P. フィシスタンパク質データベース (補足表 S5) は、注釈のない P. フィシスのタンパク質コード領域を予測するための GeneMark-ES/ET および Augustus プログラム 66,67,68,69 の使用を含む BRAKER パイプラインを使用して生成されました。フィシスゲノム。 大西洋タラ (Gadus morhua) 予測タンパク質データベース (NCBI アセンブリ GCA_902167405.1 gadMor3.0) (予測タンパク質ファイルが利用可能) を使用して、CDS 予測をガイドする「ヒント」を入力しました。 すべてのサンプルで、C のカルバミドメチル化の固定修飾、MW の可変酸化、NQ の脱アミド化、およびタンパク質の N 末端アセチル化が可能でした。 化石サンプルでは、​​Phospho K&T および MOD も使用できました。 各サンプルについて、最初のおとり検索を実行して、誤発見率 1% の p 値を決定しました。 次に、必要に応じて p 値を調整して、エラー許容検索を実行しました。 カットオフ スコアは、Mascot アルゴリズムによって推奨される値で適用されました。 返された配列には Blast2GO ソフトウェアで注釈が付けられ、さらに Blast2GO で NCBI nr 霊長類データベースに対して実行され、Mascot の UniProt-Human データベースでは検出されなかった潜在的なヒト汚染物質がないかテストされました。 おそらくヒト夾雑タンパク質は、元の注釈の 20 単位以内の e-値、10 e-値単位以内、および e-50 以下の 10% の類似性を備えた霊長類との類似性が 90% 以上である場合、最終リストから除外されました。または、 e-value 単位が 5 以内、e-50 以上の類似性が 10% である22。 CD-HIT では重複配列が 90% 以上の類似性でチェックされました。 重複は個別に記録されますが、総タンパク質数では一緒にカウントされます。 いくつかのタンパク質は別個のペプチドとして予測されました。 これらのペプチドは、大西洋タラ (Gadus morhua) 予測プロテオーム (NCBI アセンブリ GCA_902167405.1 gadMor3.0) に対して BLAST され、既知のペプチド間の未知の配列の領域を示す XX の文字列と連結されました。

この研究中に生成または分析されたすべてのデータは、この公開された論文 (およびその補足情報) に含まれています。 質量分析プロテオミクス データは、Pride パートナー リポジトリ 70 (https://www.ebi.ac.uk/pride/login) を介して、データセット識別子 PXD036742 および https://doi.org/10.6019 で Proteomic Xchange Consortium に寄託されています。 /PXD036742。 この研究では、漁船の商業水揚げから収集された標本と博物館コレクションの化石材料のみが分析されたため、倫理的な承認や指導は必要ありませんでした。

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Perez-Riverol, Y. et al. 2019 年の PRIDE データベースと関連ツールとリソース: 定量化データのサポートを改善。 核酸研究所 47、D442–D450。 https://doi.org/10.1093/nar/gky1106 (2019)。

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この研究は、JS への国立科学センター (ポーランド) 研究助成金 2017/25/B/ST10/02221 および 2020/39/B/ST10/01253、NSF 生物学博士研究員賞 #1611943、および Zuckerman STEM 博士研究員リーダーシップフェローシップによって支援されました。 JD に、スイス国立科学財団の助成金 205321_212614 を AM に付与しました。 ARV は、研究契約 CEECIND/01528/2017 を通じて Fundação para a Ciência ea Tecnologia (FCT、ポルトガル) から支援を受けました。 サンプル処理、アミノ酸分析、タンパク質分析については、それぞれ北アリゾナ大学のアミノ酸地質年代学研究室と UCLA の NPI-Semel Institute プロテオミクス研究室の T. Bernat に感謝します。

古生物学研究所、ポーランド科学アカデミー、Twarda 51/55、00818、ワルシャワ、ポーランド

ヤロスワフ・ストララルスキー

カリフォルニア大学地球惑星宇宙科学科、ロサンゼルス、カリフォルニア州、米国

ジーン・ドレイク

レオン大学生物環境科学部、ベガザナキャンパス S/N、24171、レオン、スペイン

イシュマエル・コロナド

リスボン大学理学部動物生物学科、カンポ グランデ、1749-016、リスボン、ポルトガル

アナ・R・ヴィエイラ

海洋環境科学センター (MARE)、リスボン大学、カンポ グランデ、1749-016、リスボン、ポルトガル

アナ・R・ヴィエイラ

ワルシャワ大学地質学部、Żwirki i Wigury 93、02089、ワルシャワ、ポーランド

ウルシュラ・ラドワンスカ

米国ミシガン州イーストランシングのミシガン州立大学統合生物学部

エリザベス AC ヒース・ヘックマン

化学科、ワルシャワ大学、Pasteura 1、02-093、ワルシャワ、ポーランド

マチェイ・マズル

湖北大学材料科学工学部、武漢、430062、湖北省、中国

郭金明

生物地球化学研究所、建築・土木・環境工学部、エコール・ポリテクニック・フェデラール・ド・ローザンヌ、1015、ローザンヌ、スイス

アンダース・マイボム

先端表面分析センター、地球科学研究所、ローザンヌ大学、1015、ローザンヌ、スイス

アンダース・マイボム

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JS と JD は研究を計画し、データを分析し、原稿を作成しました。 ARV と UR は、現代の耳石と一部の化石耳石の材料を提供し、同定しました。 IC は EBSD マップを作成し、結晶学的測定値を解釈しました。 MM は AFM 画像と熱重量分析を作成しました。 EACH は BRAKER を使用して P. phycis タンパク質の予測を実施しました。 GJ は TEM 分析を行いました。 JS、JD、IC、EACH、GJ、AM は結果の解釈と原稿の執筆に貢献しました。

通信相手はヤロスワフ・ストラルスキです。

著者らは競合する利害関係を宣言していません。

シュプリンガー ネイチャーは、発行された地図および所属機関における管轄権の主張に関して中立を保ちます。

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転載と許可

Stolarski、J.、Drake、J.、Coronado、I. 他化石魚の耳石と生物鉱物結晶ホストの原始的な保存に関する最初の古プロテオーム研究。 Sci Rep 13、3822 (2023)。 https://doi.org/10.1038/s41598-023-30537-8

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受信日: 2022 年 11 月 9 日

受理日: 2023 年 2 月 24 日

公開日: 2023 年 3 月 7 日

DOI: https://doi.org/10.1038/s41598-023-30537-8

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